一、仪器基本信息

仪器型号：AKTA pure 25

生产厂家：cytiva

购置时间：2024-12

所属技术服务部：细胞与分子平台

放置位置：科技大楼204

管理人员：童伟 18771036551

仪器应用：AKTA pure 25 是Cytiva（原GE Healthcare）研发的中压液相色谱系统，专为生物大分子的精细化纯化设计。核心应用于蛋白质、核酸、多肽及病毒颗粒的制备级分离，支持亲和层析（如His-tag纯化）、离子交换、分子筛及疏水层析等多模式技术。系统具备高精度流体控制（流速0.001–50 mL/min，精度±1.2%）、全波长紫外监测（190–700 nm，三波长同步检测）及自动化操作平台（UNICORN软件控制梯度与收集），可保持热敏感生物分子活性。其兼容直径26–100 mm色谱柱，压力上限20 MPa，覆盖从微量分析到克级制备的需求，广泛应用于高校、药企及生物技术实验室的蛋白纯化与结构研究。

二、仪器操作流程

1、 开机

打开仪器的主电源，打开电脑电源。待仪器自检完毕（主机控制面板白灯常亮）。双击桌面上UNICORN 图标，进入操作界面。

2、 准备工作溶液和样品

所有的工作溶液和样品必须经过0.45μm 的滤膜过滤（样品也可高速离心后取上清使用）。缓冲液需在使用前用低频超声脱气 10min。

3、 清洗及管道准备

首先将A1 管道入口放入平衡缓冲液（binding buffer）中，将 B1 管道入口放入洗脱缓冲液（elution buffer）中，在 system control 窗口点击工具栏内的 manual，选择 execute manual instructions→pump→pump A wash 和 pump B wash，选中 A1 和 B1 入口，点击 execute。泵洗完成后自动停止。

4、 安装层析柱

在manual instructions 里选择 pump→system flow，输入流速 1 ml/ml，insert；选择 Alarms→alarm precolumn pressure，设置 high alarm（输入填料的耐受压力，可在填料说明书中查到），insert，execute。待Injection Valve 的 1 号位管道流出溶液后，将管路接入柱子的上端，稍微拧紧后将柱下端的堵头卸掉接入管道，连上紫外流动池。

5、 开始纯化：

1）选择检测波长，Monitors→Wavelength→UV1, UV2, UV3 (可以只打开一个波长) 等待柱子平衡好了（观察 UV、COND、pH 的数值和变化趋势）就可以准备上样。此时将紫外调零，选择 Monitors→auto zero UV，exectue。

2）用样品环上样：将样品吸进注射器，推掉气泡，从 injectionValve 的 3 号位推入, 推好后不要取下注射器。在 manual instructions 里选择 flowpath→injection Valve→inject，execute。

3）用泵上样：将 A2 入口放入样品中，manual instructions 里选择 flowpath→A inlet→A2, insert,flowpath→injectmark, insert, execute 待样品上完后，在 manual instructions 里选择 flowpath→A inlet→A1,使用平衡缓冲液继续清洗柱子。

2),3)任选一种方式

4）洗脱：上样后用平衡缓冲液尽量将穿透峰洗回基线。在 manual instructions 里选择 pump→gradient，按照自己的工艺选择 target B（100％）和 length（10CV）。

5）设定收集：固定体积收集：选择 Fraction collection→Fractionation, 选择收集管 tube type，输入每管收集体积，exectue。结束固定体积收集选择 Fraction collection→Stop fractionation，exectue。峰收集：选择 Fraction collection→Peak fractionation Parameters→UV Level, 设定峰收集的参数，选择Fraction collection→Peak fractionation 设定峰收集每管收集的体积，exectue。结束峰收集选择 Fraction collection→Stop peak fractionation，exectue。

6、 清洗泵及卸下层析柱：

将A1 和 B1 入口放入纯水中，启动 pump wash 功能冲洗 A 泵和 B 泵及整个管路。然后再将 A1 和 B1 入口放入 20％乙醇中，同样操作让乙醇充满整个管路。给系统一个慢流速，设置系统保护压力，然后先拆柱子的下端接头，在滴水的状态下将堵头拧上。再拆柱子上端接头，拧上上端堵头。整个过程防止气泡进入层析柱。

7、 关闭电源：

从软件任一窗口File 命令栏中点击退出。关闭 ÄKTA 主机电源，关闭电脑电源。

三、仪器注意事项

1. **气泡防控**

- 所有缓冲液需严格**脱气过滤**（0.22 μm），管路需充分灌注排空，避免气泡损伤泵阀或干扰检测。

2. **样品预处理**

- 上样前必须离心（14,000 rpm）或过滤（0.45 μm），**严禁颗粒物/沉淀物**进入系统，防止色谱柱堵塞。

3. **色谱柱保护**

- 流速/压力勿超柱限（通常≤5 mL/min，压力≤20 MPa），**新柱需预平衡2小时以上**；使用后立即清洗，低温保存于20%乙醇中。

4. **系统维护**

- 每日结束需用纯水冲洗流路，**长期停用需灌注20%乙醇防腐**；定期更换泵密封圈及紫外灯。

5. **安全操作**

- 强酸/碱溶液需及时冲洗，避免腐蚀流路；收集有毒样品时启用废液封闭系统。

>关键提示：始终通过**UNICORN软件监控压力曲线，异常波动立即暂停检查！