一、仪器基本信息

仪器型号：N-STORM

生产厂家：尼康

购置时间：2025.5

所属技术服务部：微纳结构技术研发部

放置位置：科技大楼1楼超分辨显微成像室

管理人员：苏专专 15799094953

仪器应用：N-STORM（Stochastic Optical Reconstruction Microscopy）是一种基于单分子定位的超分辨率显微技术，能够将光学显微镜的分辨率提升至纳米级别（横向分辨率约20 nm，轴向分辨率约50 nm）。使用超分辨显微镜 N-STORM 时，需先按顺序启动仪器，用电脑登录系统并选择对应模式。调整镜头和激光参数，通过实时观察调整图像质量，曝光采集数据，结束后按顺序关机，并注意样本制备和保存条件。

二、仪器操作流程

1. 操作前准备

培训要求：新用户需通过预培训（提前24小时联系管理员）和现场指导，未经培训禁止上机。

环境与着装：穿实验服进入平台，确认物镜清洁无油污，检查激光器冷却系统状态。

2. 样品制备：

(1) 清洗Lab-Tek®Ⅱ 八孔板的底部玻片，用1M KOH浸泡15 min，用超纯水冲洗干净，在超净台里用UV紫外消毒30 min;

(2) 将细胞以50-60%的密度种在八孔板的每个孔内;3.用500 μL PBS冲洗一次;

(3) 室温下，用200 μL固定液固定10分钟,

(4) 用200 μL替换液 NaBH₄替换掉固定液，在摇床上轻摇7分钟，此后除了第12步和第14步，其他都需要在摇床上轻摇;

(5) 500 μL PBS 洗3次，每次5分钟口，轻摇

(6) 200 μL Blocking buffer轻摇20分钟

(7) 弃掉Blocking buffer;

(8) 加入150 μL一抗稀释液，室温下轻摇30分钟

(9) 用200 μL Washing Buffer 洗5次，每次15分钟，轻摇

(10) 加入150 μL二抗稀释液，室温下轻摇30分钟，需避光

(11) 用200 μL Washing Buffer洗3次，每次10分钟，轻摇;

(12) 500 μL PBS洗一次，5分钟，轻摇:

(13) 用固定液进行后固定，静置10分钟

(14) 用500 μL PBS 洗3次，每次5分钟:

(15) 存放在PBS中，如果要保存较长时间，建议加入20mM看氮化钠

(16) 使用STORM专用探针（如Alexa Fluor 647、Cy3-Cy5染料对），标记目标蛋白。

3. 仪器启动流程

（1）开机顺序：

- 按机身标注顺序开启1-5号开关。

选择桌面“NIS-Elements-AR-5.4.2”

- 电脑登录密码：nikon，选择N-STORM系统进入操作界面。

（2）样品固定

物镜上滴加一滴硅油。

将八板板或者共聚焦小皿等置于操作台上，并用夹子固定

点击PFS，并调整物镜高度，直到听到“嘀嗒”声，则到达焦面。

具体参考视频操作

物镜选择界面选择100X，并右键点击如图中位置，进行焦面二次聚焦。

（4） 物镜选择与切换：

Ø 点击软件界面镜头图标切换物镜（满色表示切换成功）：

Ø 硅油物镜（如CFI SR HP Plan Apochromat 100XC Sil）：用于活细胞/组织深层3D成像，折射率匹配活细胞。

Ø 普通油镜（如`CFI SR HP Apochromat TIRF 100X Oil）：固定细胞样本常规成像。

4. 成像操作步骤

（1）样本定位：

使用Eye分区下的DAPI通道预览样本，通过蓝染细胞核定位目标区域。

（2）参数设置：

Ø 激活/激发激光：依次开启405nm（激活）、561nm/633nm（激发）激光，能量调整范围建议5-20%。

Ø 曝光与增益：

Ø 初始设置：曝光时间20-50ms，sCMOS相机增益300-500，确保单帧光子数在4000-10000区间（优化信噪比）。

Ø 高速模式：选择20×20μm视野，采集速度500Hz（活细胞动态观测）。

选择2D或者3D进行参数设置，并对帧数进行选择，初次成像一般选择10000帧，若成像连续性比较差，二次成像可选择20000~50000帧进行成像。

点击shutter，将647驱动光从0.5%开始逐步加强，直至100%，将分子驱动至“暗态”

驱动10 秒之后

选中405激发光进行激发，并点击“run now”进行扫描成像。

（3）漂移校正：

加入荧光小球（100nm金颗粒），勾选`Drift Correction`，系统自动计算XYZ轴漂移并实时补偿。

（4）图像采集与重构：

点击Run Now开始采集，系统自动记录数万帧原始数据。

软件执行单分子定位（高斯拟合）及3D重构（柱面镜分析Z轴形变）。

成像完毕之后，选择主菜单Application下拉最后一个选项“N-storm。。。”

选择成像的文件，导入刚拍摄的结果。

选择“Start N-storm Analysis”

一般选择逐帧分析，然后开始分析。

分析结束，选择右侧工具栏图中按钮，进行区域选择放大，左键选中，右键确认，并单击主菜单相机按钮。

出现的新界面左下角进行颜色选择，一般选择红色或者绿色。

操作界面空白处右键

选择“analysis controls”右开菜单选择“intensity profile”

选择箭头，在放大的图片中，选择能分辨的两个点

2D成像则选择图中按钮，进行粒子之间距离测定，若是3D成像，可选择右侧按钮进行粒子距离测定

如图所示，所测试的两个分子之间的距离是24 nm。

（5）多色成像：

Ø 顺序激活法：切换不同活化激光（如405nm→488nm→561nm），分别采集各通道。

Ø 连续激活法：单染料多色成像时，调整激光强度比例避免通道串扰。

4. 关机流程

1. 关闭激光和`Live`模式，保存数据（`File → Export`，勾选标尺）。

2. 物镜清洁：用无水乙醇擦拭油镜，硅油物镜需专用清洁纸，确认无残留。

3. 按8→1逆序关闭开关，填写《仪器状态登记表》并扫码上报。

三、仪器注意事项（或相关管理规定）

1. 物镜与样本处理

物镜保护：

Ø 硅油物镜严禁接触普通镜油，使用后立即清洁，否则可能永久损伤涂层。

Ø 违规留污将触发平台处罚（如禁用账号、赔偿）。

Ø 样品兼容性：STORM需特殊制样（如抗淬灭封片剂），常规共聚焦样本可能不适用。

2. 激光安全与设备维护

激光安全：

Ø 勿直视激光出口，操作时佩戴防护镜；633nm激光功率超过5mW需申请安全许可。

Ø 漂移控制：

Ø 活细胞成像需开启温控（CO₂维持），避免呼吸漂移；长时程拍摄（>30min）需每1min校正漂移。

3. 数据与操作规范

Ø 存储管理：原始数据（.nd2格式）建议实时备份，单次实验数据量可达100GB。

Ø 违规禁令：

Ø 禁止在平台充电（手机/笔记本等），禁止未穿实验服操作，违者禁用权限。

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表：成像模式参数设置指南

总结

尼康N-STORM的操作核心在于精准控制单分子激活密度与实时漂移校正。严格遵循物镜清洁规范（ 硅油/油镜分区分拭）、参数优化（光子数4000-10000）及环境稳定性控制（温控+防震台），可确保分辨率稳定在20nm（XY）及50nm（Z）。建议首次用户在管理员监督下完成全流程操作，避免因小失误导致设备损伤或数据失效。