一、仪器基本信息

仪器型号：WITec alpha 300RI

生产厂家：OXFORD

购置时间：2025.5

所属技术服务部：微纳结构技术研发部

放置位置：科技大楼1楼拉曼成像光谱仪室

管理人员：张汉强 15959644883

仪器应用：①生命科学：在生命科学研究中，alpha 300 RI能够提供无损成像技术，无需对样品进行固定染色，适用于真核细胞核的拉曼-荧光联用显微成像等应用。②生物医学：该系统在生物医学研究中表现出色，能够用于研究细胞和组织的化学特性，特别是在不需要对样品进行复杂处理的情况下进行三维成像。③化学材料：可直接对材料表面进行分子层面的原位表征，无需接触或前处理，适用于半导体晶圆应力检测、表面污染物分析等场景；可快速识别食品添加剂、药物成分及晶型，确保食品安全与药品质量合规性。

二、仪器操作流程

1. 开机

打开仪器下方的开关，仪器开机；选择需要使用的激光器（533nm或者632nm），将激光器后面的钥匙顺时针从OFF拧到ON，激光器指示灯亮（激光器需预热10min左右）；调整光栅为对应的激光波长；

2. 激光波长校准（每天第一次使用仪器或者关机后再次开机都需要进行校正；若有人使用过，此步骤可跳过）

（1）将标准硅片按照下方所示放置到倒置显微镜样品架上（注意：硅片要朝下）；

（2）将Nikon显微镜的物镜旋转到1（20倍），光源旋转到1（明场）；

（3）打开操作软件（WITec Control 7.0），仪器与软件进行连接，可以查看右下角软件状态（显示全部打钩即为正常连接）；将WITec Video Control选择为20X，在低倍下查找样品； 

（4）使用手柄调整相应的位置，将光源进行对焦；

（5）在低倍下对焦完成之后，视野如下所示；然后，点击下方的按钮，进行大视野拍照（用来后续的拉曼测试，地图定位，非常重要，一定要做），获得相应的图片；

注：此方法获得的图片有明显的背景，但该结果大部分只为了定位；若对上述结果不满意，可以对背景进行校正，方法如下：

然后视野调到需要拍摄的位置，再按照（5）的方法进行大视野拍照，得到下面的图片。

（6）微调样品焦距：将Nikon显微镜的物镜旋转到3（60倍），光源旋转到2（拉曼测试，暗场），此时软件视野界面为黑色。软件界面调整相应物镜的倍数，

将激光数值调小，打开激光按钮，界面显示绿光，微调Z轴使激光聚焦到一点。调整结束后，关闭下图步骤3的激光按钮。

（7）激光校正：点击左侧Single Spectrum下拉菜单，然后点击Acq. Single Spectrum进行拉曼光谱测量；测量结束后，在键盘大写的状态下按F键，弹出对话框，将Display Options菜单下的Digits数值修改为1，回车，使拉曼峰显示1位小数点；

在拉曼光谱图单击鼠标右键，选择Wavelength =532nm/Change Excitation Wavelength，弹出Change Excitation Wavelength对话框；通过键盘的上下键调节Excitation Wavelength的数值，使得光谱中标注的峰数值在520.7左右（520.7为硅的标准峰值，误差在±0.5nm之内）；

点击WITec Video Control下的Menu/Advanced/Change LaserWavelength，弹出Change LaserWavelength对话框；将上述调节好的Excitation Wavelength的数值复制到Wavelength处，点击OK，即完成激光波长校正。

3. 样品测试

将标准硅片样品换成所需测量的样品，按照上述“2. 激光波长校准”的步骤从（1）到（6），然后就可以进行相应测试。

（1）拉曼光谱扫描

①单光谱扫描

②多光谱扫描（适合同一个样品不同位置扫描）

在Sample Raster/Process Script/Command Line 输入singlespectrum，然后点击Point List Editor，然后在之前拍照的图片中选择需要测试的点，在Point Viewer中点击添加按钮；可以添加多个点。选择多个点，点击Start Raster，进行多个点的拉曼光谱测试。（此方法使用Single Spectrum参数，若对参数有特殊要求，需提前修改）

（2）线扫描

①XY扫描（水平方向扫描）：在Line Scan/Listen Line下选择Line（Multiple），在地图上划一条线，即为需要扫描的范围，然后在No. of Points中设置所选择的线需要分成多少个点；然后积分时间和累计次数自行设置，设置完成后，点击Start Line Scan进行扫扫描。

②Z轴扫描（深度扫描）：在Line Scan/Listen Line下选择Line（Multiple），在地图上点击一个点，在Start Point/Start Z和End Point/Start Z中填写需要扫描的深度（比如分别设置为–2和2，则扫描4uM的深度），点击Start Line Scan进行扫扫描。

（3）拉曼成像扫描

①XY轴扫描（平面扫描）：在Large Area Scan/Scan Method下选择Area，在Geometry/Listen Position下选择Area（Multiple），在地图上画扫描区域（也可以在Width和Height中设置范围），然后设置Points per Line和Lines per Image的数值（Points per Line和Lines per Image的数值分别为Width和Height的3~5倍左右），设置Integration Time（不要太大，不然时间很久，默认0.01）；最后点击Start Large Area Scan进行扫描。

②Z轴扫描（深度扫描）：在Large Area Scan/Scan Method下选择Area，在Geometry/Listen Position下选择Depth by Line（Multiple），在地图上画扫描区域（也可以在Width中设置范围），设置Depth的数值，然后设置Points per Line和Lines per Image的数值（Points per Line和Lines per Image的数值分别为Width和Height的3~5倍左右），设置Integration Time（不要太大，不然时间很久，默认0.01）；最后点击Start Large Area Scan进行扫描。

③XYZ轴扫描（3D扫描）：

在Large Area Scan/Scan Method下选择Stack，在Geometry/Listen Position下选择Area（Multiple），在地图上画扫描区域（也可以在Width、Height和Depth中设置范围），然后设置Points per Line、Lines per Image和Layers per Scan的数值（Points per Line和Lines per Image的数值分别为Width和Height的3~5倍左右），Layers per Scan为扫描几层，数值为多少，扫描结束就有多少个数据；设置Integration Time（不要太大，不然时间很久，默认0.01）；最后点击Start Large Area Scan进行扫描。

4. 保存数据

测试完成后，点击左上角的保存按钮，弹出对话框，选择保存位置；保存完成后点击新建按钮（此步骤非常重要，如果没有点击新建，别人可能会删除你的数据）。

5. 关机

测试完成后，将Nikon显微的物镜旋转到1（20X）,光源旋转到1（明场），关闭激光光源（从ON逆时针选择到OFF）；关闭电脑。

三、仪器注意事项

1. 每次使用仪器都需要进行激光校正；

2. 仪器使用完毕后，需立即关闭激光。